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2013/2014 ; La sindrome WHIM è un'immunodeficienza rara che si manifesta nei pazienti affetti con neutropenia cronica, verruche, ipo-gammaglobulinemia ed infezioni ricorrenti batteriche e virali. La neutropenia è la diretta conseguenza dell'incapacità da parte dei neutrofili di migrare dal midollo osseo verso la periferia (Mielochetassi). Dal punto di vista genetico le cause della malattia sono da associarsi a mutazioni in eterozigosi nel gene CXCR4 con trasmissione autosomica dominante. Questo gene codifica per una proteina a sette domini trans-membrana. La porzione extra-cellulare è specializzata nel riconoscimento del ligando specifico CXCL-12 (SDF-1α) mentre la porzione intracellulare è associata alle proteine-G e quindi deputata alla trasduzione del segnale. Nei pazienti affetti da sindrome WHIM è possibile identificare mutazioni che causano la formazione di un codone di stop prematuro in CXCR4. Tali mutazioni determinano la perdita di gran parte della porzione citoplasmatica con conseguente alterazione della funzionalità della proteina, una mancata down-regolazione di CXCR4 ed una incrementata risposta al suo ligando specifico CXCL12 (SDF-1). La ragione principale di questa alterazione è la perdita di regioni ricche in serine e treonine, siti di fosforilazione importanti per il corretto funzionamento di CXCR4. L'attività di CXCR4 può essere regolata, tramite trans-attivazione, dal recettore CXCR7. Lo studio di quest'interazione è di notevole interesse dato che sono state riscontrate malformazioni cardiache simili a quelle osservate nella Tetralogia di Fallot sia in modello murino mutato in CXCR7 sia in alcuni pazienti WHIM. Caratterizzare le diverse mutazioni di CXCR4 può aumentare la comprensione genetico-molecolare dei meccanismi che causano la sindrome WHIM. Durante il corso di dottorato di ricerca, mi sono occupato della caratterizzazione di una nuova mutazione in CXCR4 e dello studio di mutazioni già note mediante esperimenti in vitro. Grazie al contatto diretto con i pazienti è stato possibile analizzare le mutazioni e i relativi effetti su cellule linfocitarie attivate (PHA-T blasti) provenienti da campioni di sangue periferico. Questi studi hanno compreso sia saggi funzionali, come la chemotassi e il flusso del calcio intracellulare, sia biologici e molecolari, come lo studio della fosforilazione delle proteine ERK. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati dopo stimolo del recettore CXCR4 mediante un ligando specifico, la chemochina SDF-1α. Le analisi eseguite sulle cellule dei pazienti con mutazioni fino ad ora note hanno sempre mostrato un comportamento gain of function del recettore CXCR4: gli effetti evidenti in seguito ad esposizione al suo ligando specifico CXCL12 sono l'iper-fosforilazione delle proteine ERK1/2, l'aumentato flusso del calcio intracellulare e l'aumentata risposta chemotattica. Oltre a questo abbiamo trovato e caratterizzato una nuova mutazione di CXCR4 (L317fsx3) non descritta in letteratura, che genera un codone stop situato più a monte delle mutazioni finora descritte. Questa mutazione genera un recettore CXCR4 completamente privo della porzione citoplasmatica contenente tutti i siti di fosforilazione del recettore. Sulle cellule di questi pazienti abbiamo valutato per primo la via di segnale delle MAP chinasi, in particolare la fosforilazione di ERK1 ed ERK2, ed in seguito il flusso del calcio intracellulare e la chemotassi in risposta dose-dipendente a SDF-1. Al contrario delle altre mutazioni già note, le analisi condotte sulle cellule T attivate dei pazienti con mutazione L317fsx3 hanno mostrato una ridotta capacità di fosforilazione delle proteine ERK1/2, una ridotta chemotassi e diminuzione del flusso del calcio intracellulare in risposta allo stimolo con SDF-1α. Il risultato della fosforilazione delle proteine ERK1/2 si è ripetuto anche sulle cellule della linea B immortalizzate con il vius Epstein Barr (EBV) dei pazienti in questione. Per confermare i risultati ottenuti sulle cellule dei pazienti, cellule HEK293 sono state trasfettate con un vettore eucariotico wild-type, un vettore eucariotico mutagenizzato L317fsx3 o con un vettore eucarotico mutagenizzato per la mutazione più frequente e rappresentativa (R334X). Su queste cellule è stata valutata la fosforilazione delle proteine ERK1/2. In accordo con i risultati ottenuti sulle cellule dei pazienti, la trasfezione con il vettore mutagenizzato L317fsx3 riduce la capacità di CXCR4 di fosforilare le proteine ERK e di mediare il flusso del calcio intracellulare rispetto alle cellule trasfettate con il plasmide wild-type o il plasmide contenente la più frequente mutazione R334X. I risultati che abbiamo visualizzato in questi esperimenti hanno mostrato un effetto differente della nuova mutazione rispetto a quelli causati dalle mutazioni precedentemente caratterizzate; questo comportamento potrebbe essere dato dalla perdita dell'intera coda citoplasmatica dal parte del recettore CXCR4. Questo troncamento della coda citoplasmatica comporta la perdita di tutti i siti di fosforilazione del recettore in grado di associarsi alle proteine G e necessari alla corretta trasduzione delle diverse vie di segnale. Questa incapacità di legare le proteine G da parte del recettore CXCR4 comporta una riduzione della funzionalità recettoriale. ; XXVII Ciclo ; 1983
Note:
Dissertation Università degli studi di Trieste 2015
Language:
Italian
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