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El campo de la nanotecnología está expandiéndose de forma exponencial y con ello la preocupación social sobre los posibles efectos de sus productos (nanomateriales; NMs) en los organismos vivos. Dado que las principales vías de exposición a los NMs son el contacto dermal, la inhalación y la ingestión, la barrera intestinal adquiere gran importancia debido a la presencia de NMs en comida y envases de comida, además de su presencia en muchos otros productos de uso diario. En este contexto, el objetivo de esta Tesis es desarrollar un modelo intestinal formado por células Caco-2 para la evaluación del riesgo de NMs. Las células Caco-2 son células de adenocarcinoma de colon que tienen la capacidad de diferenciarse en enterocitos del intestino delgado. Bajo el marco del proyecto NANoREG, los resultados obtenidos han demostrado que se ha desarrollado con éxito un protocolo robusto para obtener una barrera in vitro intestinal estable y reproducible compuesta por estas células Caco-2 diferenciadas. Usando concentraciones subtóxicas de TiO2NPs, ZnONPs, SiO2NPs, CeO2NPs, AgNPs y MWCNT durante 24 horas, se han realizado diferentes tipos de análisis, a saber: a) evaluación de la integridad y permeabilidad de la monocapa, b) internalización celular, c) translocación de los NMs, d) evaluación del daño genotóxico y d) evaluación de la integridad de la monocapa a través de cambios de la expresión del mRNA. Los resultados tras la exposición a concentraciones subtóxicas no mostraron alteración en la integridad ni en la permeabilidad de la monocapa. Además, se observó internalización de las AgNPs tanto en el citoplasma como en el núcleo, mientras que las TiO2NPs y las CeO2NPs se encontraron sedimentadas en la membrana apical de las células. La capacidad de evaluar la translocación de los NMs a través de la barrera celular resultó ser muy limitada. El TEM-EDX, la microscopía confocal y el ICP-MS produjeron resultados de los que se puede concluir una limitada translocación de TiO2NPs, ZnONPS y CeO2NPS. En la evaluación del daño genotóxico mediante el ensayo del cometa, se observó que sólo las AgNPs son capaces de producir daño oxidativo en el DNA y tan sólo en la concentración más alta analizada (50 μg/mL). En la evaluación de la expresión del mRNA de genes de transportadores celulares (SI y SLC15A1) y de adhesión célula-célula (OCCLUDIN y CLAUDIN2), los resultados mostraron mucha variabilidad entre réplicas y no se encontraron cambios significativos en ninguno de ellos tras la exposición a AgNPs. Al margen del proyecto europeo y con el fin de evaluar el riesgo de la exposición a NMs a largo plazo, se expusieron las células Caco-2 en su estado no diferenciado a concentraciones subtóxicas de AgNPs durante 6 semanas evaluándose su capacidad de transformación. Estas células mostraron necesitar un tiempo de adaptación en el que disminuyen el ritmo de división debido a la exposición hasta que lo recuperan a lo largo del tratamiento. Tras 6 semanas de exposición, las células Caco-2 expresan algunas características de célula transformada: a) aumentan su nivel de proliferación, b) adquieren la capacidad de crecer en soft-agar, y de promover el crecimiento en soft-agar de otras células tumorales (HCT116), c) aumentan la secreción de 12Ps, y d) incrementan su capacidad migratoria. Sin embargo, la exposición no mostró inducir cambios en la expresión de los genes involucrados en EMT, adhesión celular, citoesqueleto o supresores de tumores. A pesar de esto, los resultados globales indicarían que las AgNPs no son seguras en términos de carcinogénesis. ; The field of nanotechnology is increasing every day. For this reason, the social concern about the possible effects of their products (nanomaterials; NMs) in living organisms is also growing. Since the main routes of exposure to NMs are dermal contact, inhalation, and ingestion, the intestinal barrier is very important due to the presence of NMs in food and food packaging, in addition to its presence in many other daily products. In this context, the objective of this Thesis is to develop an intestinal model formed by Caco-2 cells in order to assess the risk of NMs. Caco-2 cells are from colon adenocarcinoma and have the capacity to differentiate into enterocytes of the small intestine. Under the framework of the NANoREG's project, the results have shown that we have successfully developed a robust protocol to obtain stable and reproducible in vitro intestinal barrier composed of these differentiated Caco-2 cells. Using sub-toxic concentrations of TiO2NPs, ZnONPs, SiO2NPs, CeO2NPs, AgNPS and MWCNT for 24 hours, we have performed different types of analysis: a) assessment of the integrity and permeability of the monolayer, b) cellular internalization, c) translocation of NMs, d) evaluation of genotoxic damage, d) assessment of the integrity of the monolayer through changes in mRNA expression. The results after exposure to sub-toxic concentrations showed no alteration in the integrity or the permeability of the monolayer. Furthermore, internalization of AgNPS was observed in both the cytoplasm and nucleus while TiO2NPs and CeO2NPs found sedimented on the apical membrane of cells. The ability to evaluate the translocation of NMs through the cell barrier proved to be very limited. TEM-EDX, confocal microscopy, and ICP-MS showed limited translocation of TiO2NPs, ZnONPs, and CeO2NPS. In the evaluation of genotoxic damage by comet assay, it was observed that only AgNPS are capable of producing oxidative DNA damage and only at the highest concentration tested (50 μg/mL). In assessing mRNA expression of genes of cellular transporters (SI and SLC15A1) and cell-cell adhesion (OCCLUDIN and CLAUDIN2), results showed a lot of variability between replicates and no significant changes were found in any of them after exposure to AgNPS. Besides the European project and in order to assess the risk of exposure to NMs in the long term, Caco-2 cells in their undifferentiated state were exposed for 6 weeks to sub-toxic concentrations of AgNPS evaluating its transformation capacity. These cells were subjected to a period of adaptation in which the cells decreased the rate of division due to exposure until regaining it at the end of the treatment. After 6 weeks of exposure, the Caco-2 cells expressed some features of the transformed cells: a) increased the proliferation rate, b) acquired the ability to grow in soft agar, and promoted the growth of other tumour cells (HCT116) in soft-agar, c) increased the secretion of MMPs, and d) increased their migratory capacity. However, exposure didn't show changes in the expression of genes involved in EMT, cell adhesion, cytoskeleton or tumour suppressors. Despite this, the overall results indicate that the AgNPS are not safe in terms of carcinogenesis.
Note:
Dissertation [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona 2016
Language:
Spanish
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