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The haemotrophic bacterium Mycoplasma suis is the causative agent of infectious anaemia in pigs (IAP), a worldwide and economically significant disease. The acute disease is characterised by severe anaemia, high bacteraemia, fever and high-grade hypoglycaemia. Antibiotic treatment using oxytetracyline protects the pigs against death, but does not eliminate the bacterium from the host. Hence, chronic low-grade M. suis infections are predominant. Clinical signs of the chronic form are mild anaemia, growth retardation in piglets, decreased reproductive efficiency in sows, and increased susceptibility to other infections. The crucial barrier to systematic analyses of the biology of M. suis is that M. suis as well as all known haemotrophic mycoplasmas has not been cultivable in vitro so far. Thus, M. suis research still relies on the splenectomised pig model, and on animal-toanimal passages, a method connected with serious ethical concerns. In this Ph.D. thesis presented, I describe efforts to establish an in vitro cultivation system for M. suis as a model system for all haemotrophic mycoplasmas with the aim to replace animal experiments. I attempted M. suis propagation by inoculating different Mycoplasma media with anti-coagulated blood from experimentally infected and acutely diseased pigs, and by systematically diversifying proved culture techniques for mycoplasmas. Some cultivation approaches used led to a kind of maintenance of M. suis over 12 weeks in liquid M. suis cultures. Scanning electron microscopic analysis of subcultured M. suis cells on agar plates provided evidence: for the first time, propagated M. suis cells outside the natural host i.e. the pig. These propagated M. suis were packed in dense microcolonies consisting of small irregular M. suis nanocells indicating a kind of nanotransformation. Interestingly, these unique M. suis nanoforms are able to infect healthy porcine erythrocytes in vitro, thus indicating viability and infectivity. One main clinical sign of acute IAP is severe and often life-threatening hypoglycaemia caused by glucose consumption of M. suis itself. Due to the not-yetestablished in vitro culture system and to missing whole genome sequences, little was known about the metabolism and the transport capacities of M. suis. Therefore, the second part of the Ph.D. thesis presented aimed to explore this part of the M. suis biology in more detail. For this, a random shotgun screening approach in combination with subsequent Southern blot hybridisation of genomic M. suis DNA was used. Thereby the transport system for the glucose uptake (i.e. the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system PTSglc uptake system), the pre-protein secretion machinery (Sec-translocase), the phosphate (Pi)-specific import system (Pst-transporter) and several glycolytic enzymes of M. suis were identified and their genomic context was characterised. The genomic organisation of most of the genes identified was analogous to other mycoplasmas. Only the organisation of the Pst-transporter differs from other mycoplasmas. In M. suis, PhoU, the putative negative regulator of the Pho regulon, is not encoded together with the subunits of the Pst-transporter, whereas in other mycoplasmas, the pst-genes are organised in a polycistronic pstSCAB-phoU operon. Adhesion to erythrocytes is one of the main characteristics of haemotrophic mycoplasmas. Electron microscopic investigations revealed that the adhesion is mediated by fine bacterial fibrils. Recent studies have shown that a glycolytic enzyme i.e. the GAPDH protein MSG1 is involved in the adhesion. Within the present Ph.D. study a second glycolytic protein i.e. α-enolase of M. suis was identified by the above shotgun screening, and further characterised as potential adhesion and virulence factor. The M. suis α-enolase was expressed in Escherichia coli and the resulting purified recombinant protein was used to raise an anti-M. suis α-enolase rabbit serum and to perform characterisation assays. Interestingly, despite the missing classical signal sequence for export, M. suis α-enolase is a membrane-localised and surfaceaccessible protein with immunogenic and adhesive properties. Further studies are necessary to evaluate the role of M. suis α-enolase as a putative part of the M. suis adhesion complex. Mycoplasma suis gehört zur Gruppe der nicht-kultivierbaren, hämotrophen Mykoplasmen. M. suis verursacht beim Schwein die porcine infektiöse Anämie (IAP), eine weltweit verbreitete Erkrankung von erheblicher ökonomischer Bedeutung. Die akute Verlaufsform ist gekennzeichnet durch schwerwiegende Anämie, hochgradiger Bakteriämie, Fieber und lebensbedrohender Hypoglykämie. Mittels antibiotischer Behandlung mit Oxytetrazyklin können betroffene Schweine von klinischen Symptomen geheilt werden, jedoch ist eine vollständige Erregereliminierung nicht möglich. Infolgedessen findet man gehäuft chronische M. suis Infektionen. Symptome der chronischen Verlaufsform sind geringgradige Anämie, Wachstumsretardierung bei Ferkeln, sinkende Fortpflanzungsleistung bei Sauen sowie eine gesteigerte Anfälligkeit für andere Infektionen. Eine systematische Aufklärung der M. suis Pathobiologie ist aufgrund der Unkultivierbarkeit des Erregers stark beeinträchtigt. Für die Vermehrung von M. suis wird nach wie vor das splenektomierte Schweinemodell verwendet, eine Methode mit ernsthaften ethischen Bedenken. Die vorliegende Ph.D. Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung eines in vitro Kultursystems für M. suis, das als Ersatz für die Vermehrung im Tiermodell und als Modellsystem für alle hämotrophen Mykoplasmen dienen soll. Die Vermehrung von M. suis wurde in verschiedenen Mykoplasmen-spezifischen Medien durchgeführt, die mit antikoaguliertem Blut von experimentell infizierten und akut erkrankten Schweinen inokuliert wurden. Ausserdem wurden die für Mykoplasmen geprüften Kulturtechniken systematisch verändert. In mehreren Kulturansätzen in Flüssigmedien konnte erfolgreich eine Art in vitro Maintenance" erreicht werden: über einen Zeitraum von 12 Wochen konnte M. suis auf einem konstanten Niveau in den Kulturen nachgewiesen werden. In Subkulturen aus diesen Kulturen auf festen Nährmedien konnten in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen erstmals vermehrte M. suis Zellen ausserhalb des Wirts nachgewiesen werden. Es waren dicht gepackte Mikrokolonien aus kleinen, unregelmässigen M. suis Organismen sichtbar, welche erste Hinweise auf eine Art Nanotransformation von M. suis lieferten. Interessanterweise waren diese M. suis Nanoformen fähig, porcine Erythrozyten in vitro zu infizieren. Dies ist ein Indiz für die Viabilität und Infektiosität dieser M. suis in vitro Kulturformen. Ein typisch klinisches Symptom der akuten IAP ist eine schwerwiegende, oft lebensbedrohliche Hypoglykämie, die durch den Glukoseverbrauch von M. suis selbst verursacht wird. Aufgrund des fehlenden Kultursystems und bis vor kurzem unbekannter Genomsequenzen war bislang wenig über den Metabolismus und die Transportsysteme von M. suis bekannt. Daher wurde im zweiten Teil der vorliegenden Ph.D. Arbeit dieser Bereich der M. suis Biologie näher beleuchtet. Dazu wurden M. suis Genombibliotheken sequenziert und nachfolgend Southern Blot Hybridisierungen von genomischer M. suis DNA durchgeführt. Dabei wurden das Transportsystem für die Glukose-Aufnahm(Phosphe oenolpyruvate:Zucker Phosphotransferase PTSglc System), die Präprotein-Sekretionsmachinerie (Sec- Translokase), ein Phosphat (Pi)-spezifisches Importsystem (Pst-Transporter) und verschiedene glykolytische Enzyme von M. suis identifiziert und ihr Genomkontext charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die Genomorganisation von M. suis bei den meisten der untersuchten Gene eine hohe Analogie zu der von anderen Mykoplasmen aufweist. Nur die Organisation des Pst-Transporters unterscheidet sich in M. suis von anderen Mykoplasmen. In M. suis ist phoU, der putative negative Regulator des Pho-Regulon, nicht in unmittelbarer Nähe zu den anderen Untereinheiten des Pst-Transporters lokalisiert, wohingegen in anderen Mykoplasmen die pst-Gene in einem polycistronischen pstSCAB-phoU-Operon organisiert sind. Eine wichtige Eigenschaft hämotropher Mykoplasmen ist die Adhäsion an Erythrozyten. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass feine fibrilläre Strukturen die Anheftung von M. suis an die Erythrozytenmembran vermitteln. Studien haben gezeigt, dass ein glykolytisch aktives Enzym, das GAPDH von M. suis (MSG1) an der Adhäsion beteiligt ist. In der vorliegenden Ph. D. Arbeit wurde die α-Enolase, ein zweites Glykolyse-Enzym von M. suis, mittels Sequenzierung einer Gen-Bibliothek identifiziert und als potentieller Adhäsions- und Virulenzfaktor charakterisiert. Die M. suis α-Enolase wurde in Escherichia coli rekombinant hergestellt. Mit Hilfe des rekombinanten Proteins wurde ein anti-M. suis α-Enolase Kaninchen-Immunserum generiert und die Eigenschaften der M. suis α- Enolase näher charakterisiert. Dabei ...
Note:
Dissertation 2011
Language:
English
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