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Un paso limitante en la búsqueda de nuevas drogas es el acceso a bibliotecas de compuestos con propiedades biológicas interesantes. Los productos naturales (PNs) han sido muy valiosos como plataforma validada biológicamente por contener esqueletos moleculares que presentan dichas cualidades. Una metodología que utiliza a los PNs como punto de partida para la generación de compuestos con potencial actividad biológica es la Diversificación Química de Extractos. La misma apunta a producir cambios en las estructuras químicas de los componentes de extractos naturales a través de reacciones químicas seleccionadas. Estos cambios consisten en la introducción de grupos funcionales o de elementos atípicamente encontrados en derivados de origen natural, a través de reacciones que transforman grupos funcionales de alta presencia en PNs tales como los dobles enlaces y los anillos aromáticos. La incorporación de átomos de halógeno en PNs de origen vegetal resulta interesante puesto que: (a) es una estrategia comúnmente utilizada en química medicinal para alterar bioactividades de moléculas orgánicas. (b) la proporción de halógenos presentes en drogas es significativamente mayor que en PNs. (c) la mayor parte de los PNs halogenados son producidos por organismos marinos, siendo este tipo de metabolitos muy raros en otro tipo de vegetales. (d) existen reactivos que podrían introducir este tipo de elementos a través de grupos funcionales muy comunes en metabolitos secundarios tales como los dobles enlaces o los anillos aromáticos. Entre los diferentes halógenos a introducir, se seleccionó inicialmente al bromo, fundamentalmente porque presentó facilidades experimentales para su introducción en mezclas complejas. Cuando se utiliza la diversificación química de extractos, tanto el seguimiento de las reacciones como el monitoreo de su efecto sobre diferentes propiedades de las mezclas se ven dificultados tanto por la complejidad de las mezclas de partida y de las mezclas producto, como por el desconocimiento de su composición química exacta. Para llevar adelante este seguimiento se efectuó la comparación de sus (a) perfiles químicos y (b) perfiles de bioactividades. (a) Los perfiles químicos tienen como objeto estimar el éxito de la reacción y su impacto en la composición. Con éxito de la reacción" nos referimos a tratar de observar cambios en propiedades relacionadas a los grupos funcionales de alta presencia a modificar o a elementos que se desea introducir en la mezcla. Con "impacto de la reacción" nos referimos al grado en que la composición química es alterada por la reacción. Para estos análisis se utilizaron métodos cromatográficos, espectroscópicos o combinaciones de éstos, acoplados a análisis estadístico multivariado. (b) La comparación de perfiles de diferentes actividades biológicas entre los extractos de partida y los extractos halogenados se realizó a través ensayos autográficos sobre placas cromatográficas. Dado que estos métodos autográficos permiten combinar la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada (CCD) con la determinación in situ de la actividad biológica de los componentes de una mezcla de compuestos químicos, permiten pre-asignar de manera cualitativa actividades biológicas observadas en una mezcla a uno o más de los componentes de la misma. Con este fin, se utilizaron ensayos autográficos previamente descriptos para detectar compuestos antioxidantes e inhibidores de acetilcolinesterasa, xantina oxidasa y β-glucosidasa. Además se desarrollaron durante esta tesis dos ensayos autográficos enzimáticos, un ensayo para detectar inhibidores de tirosinasa y uno para detectar inhibidores de acetilcolinesterasa compatible con CCD sobre fase reversa (FR). Siendo la principal dificultad en el desarrollo de este tipo de ensayos enzimáticos encontrar las condiciones adecuadas para lograr buena reproducibilidad, homogeneidad de color, buena definición de halos y ausencia de resultados falsos, en esta tesis se estudiaron las ventajas del uso de geles como soportes enzimáticos. Además, se utilizaron diseño experimental y métodos de optimización multicriterio (Métodos de Superficie de Respuesta y uso de funciones de deseabilidad) para buscar condiciones de ensayo óptimas. Esto permitió encontrar condiciones en las que los dos nuevos ensayos presentan buena sensibilidad para la detección para inhibidores conocidos de las enzimas presentes en mezclas complejas. En un principio se bromaron 7 extractos de malezas siguiendo dos protocolos, uno utilizando bromo en solución y otro utilizando bromo inmovilizado en un soporte sólido. La comparación de los espectros de resonancia magnética nuclear de protones (RMN de 1H) combinada con análisis de componentes principales (ACP) permitió observar la separación de las muestras en grupos correspondientes a extractos naturales y a extractos modificados. El análisis del gráfico de loadings del CP2, principal responsable de la separación de los grupos, muestra que los bins con mayor efecto en este CP corresponden a una zona de desplazamiento químico de señales de dobles enlaces, uno de los grupos blanco de la reacción. Estos resultados sugieren que a pesar de que las mezclas de partida y producto son complejas y de composición mayoritariamente desconocida, existen diferencias entre estas composiciones y que estas diferencias se centran en uno de los grupos blanco de la modificación química. Este análisis se complementó utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masa de alta resolución (CLAE-EMAR), al menos un 85% de los picos presentes en los extractos testigo (ETs) desaparecen debido a la reacción (en promedio desaparece el 92 %). Paralelamente, se observa que en promedio un 90% de los picos presentes en los extractos bromados son producto de la reacción. En general lo resultados fueron muy similares para los extractos bromados producidos con ambos protocolos de reacción. Por su parte la reacción de bromación con resina provoca la desaparición de al menos un 68 % de los picos presentes en los ETs (93 % en promedio), mientras que los picos cromatográficos que aparencen en los extractos bromados como resultado de la reacción representan el 88 %. La combinación de estos datos con un ACP mostró nuevamente la discriminación de los extractos en dos grupos, uno que incluye a los testigos y otro que incluye a los modificados. De este grupo de extractos modificados, la actividad biológica más interesante se obtuvo para el extracto de Medicago lupulina L. modificado con bromo en solución, el cual presento actividad inhibitoria de la enzima β-glucosidasa. Se fraccionó el mismo por columna cromatográfica (CC) de sephadex LH-20, en este fraccionamiento se encontraron 6 fracciones que resultaron activas, las cuales se analizaron por EM mediante infusión directa en modo de ionización negativo. Entre los iones moleculares presentes en cada fracción se encuentran cuatro iones moleculares que tienen el patrón isotópico característico de los compuestos que contienen bromo en su estructura. Si bien a partir de este análisis no puede adjudicarse la actividad a ninguno de los iones moleculares nos permite corroborar que hay compuestos bromados en las fracciones activas. Con el fin introducir nuevas mezclas complejas como material de partida, posteriormente se realizó la bromación de 32 aceites esenciales (AEs) utilizando bromo en solución. Los perfiles químicos de los aceites esenciales bromados (AEBs) generados fueron comparados con aquellos de los AEs que le dieron origen utilizando CCD, RMN de1H y cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (CG-EM), observando en todos los casos diferencias interesantes. A partir de los espectros de RMN de 1H se realizó un ACP, observandose que las mezclas se separan en el CP2 en dos grupos. El gráfico de loadings del CP2 reveló que los bins con mayor influencia sobre este componente principal corresponden a zonas de desplazamiento químico de señales de dobles enlaces, dobles enlaces conjugados con anillos aromáticos y protones de metilos de alcanos en posición α a dobles enlaces. Estos resultados indican que las diferencias observadas se centran en grupos blanco de la modificación química o en grupos adyacentes a estos. Las 64 mezclas fueron además analizadas por CG-EM detectando importantes diferencias en los perfiles químicos de los AEs respecto a los AEBs. En promedio el 90 % de los picos detectados en los cromatogramas de los AEs desaparecen como resultado de la reacción y el 96 % de los picos presentes en los AEBs están ausentes en los AEs, es decir representan compuestos nuevos generados por la reacción. Además se observó que el número de compuestos promedio en los AEBs es casi el doble que en sus mezclas precursoras y que el 64 % de los compuestos generados incorporaron al menos un átomo de bromo. En conjunto estos resultados demuestran el alto impacto que tiene la reacción de bromación en la alteración de la composición ...
Note:
Dissertation Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. 2016
Language:
Spanish
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