The CFSE Distribution Assay is a Powerful Technique for the Analysis of Radiation–Induced Cell Death and Survival on a Single–Cell Level

Background and Purpose:

To analyze radiation sensitivity of cells and to monitor cellular responses to irradiation, sensitive test systems for cell death and proliferation on a single–cell level are required. Traditionally, cellular radiation survival is measured using the clonogenic assay as the gold standard. Here it is reported, that labeling of cells with 5–(and 6–)carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDASE) can be used as a highly sensitive assay to determine cellular response toward irradiation on a single–cell level.

Material and Methods:

The human malignant cell lines U937 (myelomonocytic, nonadherent), SW48 and SW480 (colorectal, adherent) were labeled with CFDASE, irradiated with either UVB (0–540 mJ/cm²), or X–rays (0–16 Gy). Cell death and proliferation were monitored by cytofluorometry and compared to the clonogenic assay for adherent SW48 and SW480 cells.

Results:

Dividing nonadherent U937 cells displayed a shift in carboxyfluorescein (CF) fluorescence in parallel with an increased cell count indicating cell proliferation. By comparison, UVB–irradiated U937 cells did not show a shift in CF fluorescence and an increase in cell count indicating cell–cycle arrest. In a mixed cell culture, only the nonirradiated cells divided and concomitantly reduced their fluorescence. Calculating the number of cell divisions it was observed that the nonirradiated cells underwent approximately six cell divisions within 7 days, whereas the irradiated cells divided only once on average. The adherent SW480 colorectal cells showed a more pronounced cell–cycle arrest after irradiation with 240 mJ/cm² UVB as compared to cells treated with X–ray up to 16 Gy. Furthermore, the CFSE assay also discriminated colorectal cell lines of different intrinsic radiosensitivities and yielded results comparable to the standard clonogenic assay.

Conclusion:

Analysis of CF distribution can be employed as a powerful add–on to the clonogenic assay to simultaneously monitor cellular responses toward irradiation on a single–cell level. It constitutes an add–on to the clonogenic assay, especially for nonadherent cells.

Hintergrund und Ziel:

Für die Untersuchung der zellulären Strahlensensibilität und der zellulären Reaktion nach Bestrahlung werden sensitive Nachweismethoden für Zelltod und Proliferation benötigt. Traditionell wird das Überleben nach Bestrahlung mit dem Koloniebildungstest als Goldstandard bestimmt. Hier wird gezeigt, dass die Markierung von Zellen mit 5–(und 6–)carboxyfluorescein– diacetat–succinimidyl–ester (CFDASE) eine sensitive Methode für die Bestimmung der zellulären Antwort nach Bestrahlung auf Einzelzellebene darstellt.

Material und Methodik:

Die humane Zelllinien U937 (myelomonozytisch, nichtadhärent), SW48 und SW480 (kolorektal, adhärent) wurden mit dem Farbstoff CFDASE markiert und mit UVB (0–540 mJ/cm²) oder Röntgenstrahlen (0–16 Gy) bestrahlt. Die Untersuchung der Proliferation und des Zelltodes erfolgte mit einem Durchflusszytometer. Die Ergebnisse wurden mit einem Koloniebildungstest für adhärente SW48 und SW480 verglichen.

Ergebnisse:

Sich teilende, nichtadhärente U937–Zellen zeigten eine Verschiebung der Carboxyfluorescein–(CF–)Fluoreszenz und einen Anstieg der Messereignisse als Zeichen der Zellproliferation. UVB–bestrahlte U937–Zellen hingegen wiesen keine Verschiebung der CF–Fluoreszenz und keinen Anstieg der Messereignisse als Ausdruck eines Zellzyklusblocks auf. In einer gemischten Zellkultur teilten sich nur unbestrahlte Zellen und verminderten entsprechend ihre Fluoreszenz. Die Auswertung der Teilungsraten ergab für nicht bestrahlte Zellen etwa sechs Zellteilungen innerhalb von 7 Tagen, während sich bestrahlte Zellen im Mittel nur einmal teilten. Die adhärente kolorektale Zelllinie SW480 wies nach Bestrahlung mit 240 mJ/cm² UVB in Vergleich zur Röntgenbestrahlung mit bis zu 16 Gy einen stärker ausgeprägten Zellzyklusblock auf. Zudem war der CFSE–Test in der Lage, kolorektale Linien unterschiedlicher intrinsischer Strahlensensibilität zu unterscheiden, und zeigte dabei mit dem Koloniebildungstest kongruente Ergebnisse.

Schlussfolgerung:

Die Analyse der CF–Verteilung eignet sich als leistungsfähiger Zusatz zum Koloniebildungstest für die simultane Untersuchung der zellulären Reaktion auf Bestrahlung und stellt eine Ergänzung zum Koloniebildungstest, insbesondere für nichtadhärente Zellen, dar.