Untersuchungen zur Aktivierung des P53-Signalweges durch genotoxische Substanzen mit unterschiedlichen Wirkmechanismen

Abstract

Krebs ist eine der häufigsten krankheitsbedingten Todesursachen weltweit. Das karzinogene Potential ist deshalb bei der Risikobeurteilung von Arzneimitteln von besonderer Bedeutung. Einer der wichtigsten Risikofaktoren für die Krebsentstehung ist die Mutagenese. Das mutagene Potential von Arzneimitteln kann jedoch aus ethischen Gründen nicht in klinischen Studien am Menschen untersucht werden. Neue Arzneimittelwirkstoffe müssen bereits vor der ersten Verabreichung ausreichend getestet sein. Dies kann nur mit präklinischen Tests <em>in vitro</em> und <em>in vivo</em> erfolgen. <em>In vitro</em> Tests in Säugerzellen spielen hier eine wichtige Rolle. <br /> Da es fatal wäre eine Substanz mit einem für den Menschen relevanten mutagenen Potential zu übersehen, sind diese Testsysteme hochsensitiv aber dadurch auch relativ unspezifisch. Es kommt aus diesem Grund zu einer hohen Rate an irrelevant positiven Testbefunden. Positive Ergebnisse dieser Tests führen häufig zu langwierigen und teuren in vivo Folgestudien oder dem Ausschluss des potentiellen Wirkstoffkandidaten aus der weiteren Entwicklung. Dies aber gilt es im Falle von irrelevanten Effekten zu vermeiden. Um ein anwendungsrelevantes mutagenes Potential hinreichend sicher auszuschließen sind zuverlässige Daten zum Wirkmechanismus notwendig. Die Identifikation von biologischen Signaturen, die es ermöglichen den Wirkmechanismus neuer Substanzen vorherzusagen, spielen in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle. Dies ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Ziel war es, Strategien zu entwickeln, welche die Prädiktion von Wirkmechanismen ermöglichen, somit die Risikobewertung verbessern und zur Reduktion von tierexperimetellen Studien beitragen. Um dieses Ziel zu erreichen wurden Untersuchungen zur Identifizierung klassenspezifischer Effekte von Substanzen aus verschiedenen gentoxischen Wirkklassen und nicht-genotoxische Kanzerogene auf die P53-Phosphorylierung/Acetylierung, die Expression P53- und Apoptose-Signalweg assoziierten Genen, Zellzyklusveränderungen und Apoptose in HepG2 (Leber), TK6 (Blut) und SH-SY5Y (zentrales Nervensystem) Zellen durchgeführt. Die Analyse der Ergebnisse erfolgte mit dem Fokus auf die Erkennung substanzgruppenspezifischer Unterschiede und potentieller Biomarker für die einzelnen Wirkmechanismen. <br /> Für die Untersuchungen wurden 10 verschiedene genotoxische, nicht-genotoxische und nicht-kanzerogene Substanzen verwendet. Die Testung wurde mit der LD20 sowie der Konzentration am NOAEL durchgeführt. Die Messung erfolgte nach Behandlung für 4 h und 24 h. Die Ergebnisse der Zytotoxizitäts-Tests haben gezeigt, dass die Zellsysteme unterschiedliche Sensitivitäten gegenüber der gleichen Substanz aufweisen. Hier wurde der größte Unterschied zwischen HepG2 und TK6 Zellen mit einem Faktor von 100 gefunden. Dies bedeutet für die Risikobewertung von unbekannten Substanzen, dass das Zielorgan eine entscheidende Rolle spielen kann. Ausschlaggebend ist hier ob ein Schwellenwert abgeleitet werden soll. Dies spielt bei direkt genotoxischen Substanzen bislang nur eine untergeordnete Rolle aber im Falle der indirekt wirkenden Genotoxine und nicht-genotoxischen Kanzerogenen kann das Zielorgan somit ein entscheidender Faktor sein. Vor diesem Hintergrund sollten die, auch für direkte Genotoxine, immer wieder diskutierten und für einige Substanzen anerkannten Schwellenwerte unter Berücksichtigung des Zielorgans abgeleitet werden.<br /> Die Klassifizierungen anhand von kürzlich publizierten Klassifizierungsgenen und 61 aus den eigenen genomweiten Genexpressionsanalysen entwickelten Klassifizierungsgenen, ermöglichten die Diskriminierung zwischen genotoxischen und nicht-genotoxisch Substanzen in den Zellsystemen TK6 und HepG2. Die besten Resultate wurde hierbei mit den Klassifizierungsgenen aus der Literatur nach Behandlung für 24 h mit der LD₂₀ in den HepG2 Zellen erzielt. Neben der Diskriminierung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Substanzen zeigte sich hier auch eine Möglichkeit, direkt und indirekt wirkende Genotoxine zu unterscheiden. Die eigenen Diskriminatoren hingegen zeigen in den HepG2 Zellen nach Behandlung für 24 h mit der Konzentration am NOAEL das beste Resultat. Hier ist zusätzlich zur Diskriminierung zwischen genotoxischen und nicht-genotoxischen Substanzen eine Unterscheidung von nicht-genotoxischen und nicht-kanzerogenen Substanzen möglich. Eine weiterführende Analyse der Genexpressions-Daten mittels gene set <em>enrichment analysis </em>(GSEA) war nicht zielführend im Hinblick auf die Identifizierung von Signaturen für genotoxische Wirkmechanismen. <br /> Zusätzlich zu den Klassifizierungsmöglichkeiten anhand der Genexpressions-profile wurde nach potentiellen Biomarkern gesucht. Die Modifikationen des P53 an Ser 15, 33, 46, 392 sowie Thr 18 und 55 und Lys 382 lieferten hierbei keine Wirkmechanismus spezifischen Signaturen. Lediglich die Phosphorylierung des P53 an Serin 15 stellt einen potentiellen Biomarker für Genotoxizität dar, der aber nicht zwischen direkter und indirekter Genotoxizität unterscheidet. Neben diesem konnten, für das verwendete Substanzset, XPC und TP53INP1, zwei Proteine der DNA-Schadensantwort, als potentielle Biomarker für Genotoxizität auf mRNA Ebene identifiziert werden. Biomarker für einzelne Wirkmechanismen konnten nicht identifiziert werden. Die P53 Modifikationen, Zellzyklusveränderungen und die Apoptose, gestützt durch die Proteindaten, liefern lediglich uneindeutige Hinweise bezüglich des Wirkmechanismus. <br /> Auf Basis der in dieser Arbeit erhobenen, für den Wirkmechanismus relevanten, Daten wurde ein Klassifizierungsmodell entwickelt. Dieses würde bei der für einen <em>weight of evidence </em>approach wichtigen Klassifizierung der Substanzen helfen.