Generierung, Identifizierung und Charakterisierung nicht alloreaktiver T-Lymphozyten zur adoptiven Immuntherapie im Rahmen allogener Stammzelltransplantationen

Abstract

Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) einer Megadosis immunoselektierter CD34+ allogener Stammzellen stellt seit Anfang der 90er Jahre eine allgemein anerkannte Therapieform maligner Erkrankungen oder angeborener Dysfunktionen des hämatopoetischen sowie des Immunsystems dar. Zu den ernstzunehmenden Komplikationen dieser Therapie zählen insbesondere die Transplantatabstoßung sowie eine verlängerte Periode der Immundefizienz mit der Gefahr lebensbedrohlicher Infektionen. In diesen Fällen kann die Applikation immunkompetenter T-Lymphozyten indiziert sein. Dieses Vorgehen ist jedoch mit einem erhöhten Risiko hinsichtlich der Entwicklung einer Graft versus Host Erkrankung (GVHD) verbunden. Aus diesem Grund entwickelten wir Strategien für eine spezifische Depletion alloreaktiver T-Zellen unter Bewahrung der adoptiven immunologischen Effekte, die durch die restlichen T-Lymphozyten hervorgerufen werden können. Um mit Hilfe einer Lymphozytenmischkultur (MLC) spezifisch aktivierte, alloreaktive T-Lymphozyten zu generieren, etablierten wir drei verschiedene Methoden der T-Zellstimulation unter Verwendung des Mediums X-Vivo15 mit einem Zusatz von 10% humanem AB-Serum. Hierzu wurden die T-Lymphozyten zusammen mit bestrahlten allogenen peripheren mononukleären Zellen (PMNC) (1), mit bestrahlten PMNC nach Übernachtinkubation mit Zytokinen (2) sowie mit bestrahlten Dendriten (3), monozytären Ursprungs kultiviert. Nach 72 Stunden exprimierten entsprechende T-Lymphozyten in unterschiedlichen Prozentsätzen die Aktivierungsantigen CD25, CD69, HLA-DR, CD71, CD95, CD161, CD28, CD90, CD8 und CD56. Dies zeigte, dass die Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten in vitro möglich war und dass neben den verwendeten Antigenen weitere Aktivierungsmarker, wie z. B. das CD71 oder das CD161 Molekül für die immunomagnetische Depletion herangezogen werden könnten. Betrachtete man dabei die Aktivierungsmarker CD25, CD69 und HLA-DR, so wurden die höchsten Aktivierungsraten erreicht, wenn die Responder-T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen ko-kultiviert worden waren, gefolgt von zytokinpräinkubierten PMNC und unbehandelten PMNC. Durch die immunomagnetischen Depletion gegen die Oberflächenmarker CD25, CD69 und HLA-DR mit Hilfe der Dynalbeads konnten die alloreaktiven T-Lymphozyten effizient depletiert werden. Dabei korrelierte die Effizienz der Depletion positiv mit der vorausgegangenen allogenen Aktivierung. Auch innerhalb der folgenden vierundzwanzigstündigen Restimulation konnte in jeder Versuchsreihe eine Reduktion der Alloreaktivität anhand einer verminderten Interferonsekretion, verglichen mit der Ausgangsituation vor Depletion bestätigt werden. Auch weitere fünf Tage später zeigte sich in dem Einbau des tritiummarkierten Thymidins in die zelleigene DNA, als Zeichen der proliferativen Zellaktivität, eine deutlich reduzierte Immunantwort nach Restimulation durch die ursprünglich verwendeten allogenen Stimulatoren. Die übrigen T-Zellen besaßen nachweislich weiterhin eine immunologische Aktivität in Gegenwart von „third party“ Zellen, Tetanus Toxoid, CMV-Antigen und PHA (Phythämagglutinin). Der Einsatz dieser Zellen im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie nach allogener Stammzelltransplantation könnte neben einem wirksamen Schutz vor Virus- und Pilzinfektionen möglicherweise auch einen Schutz vor Abstoßungsreaktionen oder einem Rezidiv der Grunderkrankung bieten.

Hematopoietic stem cell transplantation is successfully used to treat leukemia and many other hematological and immunological disorders. After allogeneic transplantation of highly purified CD34+ hematopoietic progenitor cells, delayed immune reconstitution may result in increased rates of leukemia relapse, graft rejection and severe infections. To overcome this problems donor lymphocyte infusions (DLI) could be given. However, T-cell infusions are associated with the risk of a graft-versus-host reaction, which may lead to a life-threatening disease (GVHD). We therefore investigated a depletion strategy based on the selective immunomagnetic removal of alloreactive T-cells while retaining non-alloreactive T-cells capable of graft-versus-leukemia (GVL) and antiviral activity. In order to generate specifically activated alloreactive T-cells in a mixed-lymphocyte-culture (MLC) we established three different methods of T-cell-stimulation. Therefore responder cells were cocultured with irradiated mononuclear cells, with irradiated peripheral blood cells pretreated with TNF-alpha and IFN-gamma and with irradiated monocyte/macrophage-derived-dentritic-cells. Activation kinetics of alloreactive T-cells were analyzed by FACS based on the expression of the activation markers CD25, CD69 and HLA-DR. Analyzing the coexpression of these activation markers upregulation started as early as 24h after allogeneic stimulation and peaked at 72h. In addition to the previous mentioned antigens other markers like i.e. CD71 and CD161 also seemed to be suitable for phenotypic analyses and subsequent immunomagnetic removal of alloreactive T-cells. After a defined period of 72h depending on the activation kinetics alloreactive responder cells were immunomagnetically depleted using antibodies against the activation antigens CD25, CD69 and HLA-DR and magnetic particles (Dynal). Alloreactive cells were minimized to less than 1% of CD25, CD69 and HLA-DR positive cells, which was determined by FACS-analyses using a secondary GAM-antibody. The efficiency of depletion correlated with the density of the activation antigens on alloreactive T-cells and therefore depended on the previous method of allogeneic activation. Within the next 24h of allogeneic restimulation alloreactivity still remained reduced. This was ascertained by a diminished IFN-gamma-release measured by IFN-gamma-elispot-assays and secretion-assays. Even 120h after depletion proliferation of alloreactive cells was strongly reduced, which was shown by H3-thymidine incorporation, whereas the immunological response against i.e. third party, tetanus toxoid and CMV-antigen was almost preserved. Depletion of alloreactive cells represents a promising way to avoid graft-versus-host disease throughout adoptive immunotherapy.