Untersuchung von humoralen und zellulärenImmunabwehrmechanismengegen das murine Cytomegalovirus
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Abstract
Cytomegalovirus (CMV) is a clinically relevant pathogen because it causes severe compli-cations in immunodeficient patients. Understanding immune control in healthy infected individuals is important for the development of new therapeutic strategies. For research the murine model of MCMV is used. Immunodeficient RAG-/-mice are able to control mu-rine cytomegalovirus (MCMV) infection after application of antibodies. Those antibodies can mediate different protective effector mechanisms. In the first part of this thesis we challenged the hypothesis that antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) provides in vivo an important principle of protection after MCMV infection. To establish the role of immunoglobulin-Fc mediated effector functions we constructed a recombinant MCMV expressing a heterologous antigenic protein only on the surface of infected cells but not as part of the infectious virion. Therefore partial or complete glycoprotein B of human CMV (hgB) was inserted in the genome of MCMV157luc. The resulting viruses rep-licated comparably to MCMV157luc in vitro and in RAG-/- animals. In vitro the hgB protein was detected on the surface of infected cells and in vivo it was able to induce an antibody response. Neutralizing hgB specific antibodies were incapable of neutralizing any one of the hgB expressing viruses in vitro. High doses of murine and human hgb-specific antibod-ies were tested in vivo for their antiviral capacity, but no protection could be detected. Lacking protection was observed after prophylactic as well as after therapeutic applica-tion of antibodies. Possible explanations are considered in the discussion chapter of this thesis. In the second part of this work the influence of certain effector cell types on the course of MCMV infection was determined by their gradual ablation. CD8-/- mice controlled virus infection to the same extent as fully immunocompetent C57BL/6 mice and established latency. CD8-/-JHT-/- mice, which lack both CD8+ cells and B cells, also controlled infection even after in vivo depletion of CD4+ T cells thus demonstrating the dispensability of con-ventional B and T cells. Depletion of all CD3+ cells in CD8-/-JHT-/- mice finally lead to a loss of protection. Therefore CD3+ double negative (DN) T cells were able to mediate protec-tion against MCMV infection. Only CD3+ DN T cell receptor (TCR) γδ+ cells were able to lyse infected cells in vitro. Adoptive transfer of TCRγδ+ effector cells into immunodeficient CMV infected RAG-/- mice lead to significantly reduced viral titers and prolonged survival of the recipients. Transfer of the same number of TCRαβ+ T cells could not elongate sur-vival. Likewise transfer of naîve cells showed no protective effect. These results add an-other layer to the complex immune control of CMV which might be of clinical relevance.
Abstract
Das Cytomegalovirus (CMV) ist ein klinisch relevantes Pathogen, da es in immundefizien-ten Patienten schwere Komplikationen auslöst. Für die Entwicklung neuer Therapieansät-ze ist das Verständnis der Immunkontrolle in gesunden infizierten Personen wichtig. Um dies zu untersuchen wird das Modellsystem des murinen Cytomegalovirus (MCMV) ge-nutzt. In immundefizienten RAG-/- Mäusen wird die MCMV-Infektion nach Verabreichung von Antikörpern kontrolliert. Antikörper vermitteln Schutz über verschiedene Effektormechanis-men. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Hypothese überprüft, dass im Falle der MCMV-Infektion Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC) in vivo ein wichtiges Protektionsprinzip darstellt. Um die Rolle von Immunglobulin-Fc ver-mittelten Effektorfunktionen zu untersuchen, wurde ein rekombinantes MCMV generiert, welches ein heterologes antigenes Protein nur auf der Oberfläche infizierter Zellen, nicht aber als Teil des Viruspartikels exprimierte. Hierfür wurde das Glykoprotein B des huma-nen CMV (hgB) partiell und komplett in das Genom von MCMV157luc inseriert. Die resul-tierenden Viren replizierten in vitro und in RAG-/- Mäusen vergleichbar zu MCMV157luc. hgB wurde in vitro auf der Oberfläche von infizierten Zellen detektiert und induzierte in vivo eine Antikörperantwort. Beide Viren wurden von neutralisierenden Antikörpern ge-gen hgB in vitro nicht neutralisiert. In Schutzversuchen wurden hohe Dosen muriner und humaner hgB-spezifischer Antikörper verabreicht. Es konnte keine Protektion nachgewie-sen werden. Der fehlende Schutz wurde sowohl bei prophylaktischer, als auch bei thera-peutischer Antikörpergabe beobachtet. Die möglichen Ursachen dafür werden im Diskus-sionsteil dieser Arbeit erörtert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde durch sukzessive Entfernung einzelner Zelltypen deren Bedeutung für den Verlauf der MCMV-Infektion bestimmt. In CD8-/- Mäusen verlief die Infektion entsprechend immunkompetenten C57BL/6 Mäusen bis zur Ausbildung von La-tenz. CD8-/-JHT-/- Mäuse, ohne CD8+ T-Zellen und B-Zellen, kontrollierten die MCMV-Infektion selbst nach Depletion der CD4+ T-Zellen. Dies demonstrierte die Austauschbar-keit der konventionellen B- und T-Zellen. Erst die Depletion aller CD3+ Zellen in CD8-/-JHT-/- Mäusen führte zum Verlust der Immunkontrolle. Folglich waren CD3+ doppelt negative (DN) T-Zellen am Schutz beteiligt. Zytotoxizität konnte in vitro nur für CD3+DN T-Zell Re-zeptor (TCR) γδ+ Zellen bestätigt werden. Adoptiver Transfer von präadaptierten TCRγδ+ Effektorzellen in produktiv infizierte, immundefiziente RAG-/- Mäuse reduzierte den Virus-titer signifikant und verlängerte das Überleben der Versuchstiere. Der Transfer der glei-chen Anzahl TCRαβ+ Zellen bewirkte dagegen kein längeres Überleben. Ebenso zeigte der Transfer naiver DN Zellen keinen protektiven Effekt. Diese Ergebnisse fügen eine weitere Ebene zur komplexen Immunkontrolle von CMV hinzu, welche für die klinische Anwen-dung interessant sein könnte.