Format:
125 S.
,
graph. Darst.
Content:
Onconase, RNase A, RNase A Superfamilie, Proteinfaltung, Proteindynamik, homologe Proteine, stopped-flow, quenched-flow, Fluoreszenzspektroskopie, NMR-Spektroskopie
Content:
Onconase, RNase A, RNase A superfamily, protein folding, protein dynamics, homologous proteins, stopped-flow, quenched-flow, fluorescence spectroscopy, NMR spectroscopy.
Content:
Bis heute ist nicht bekannt, ob Proteine mit einer ähnlichen Tertiärstruktur auch vergleichbare Faltungsmechanismen aufweisen. Ein Ansatz zur Bestimmung des Einflusses der Tertiärstruktur auf den Faltungsmechanismus ist die Untersuchung von Proteinen mit niedriger Sequenzidentität bzw. -ähnlichkeit und einer vergleichbaren Tertiärstruktur. Onconase® (ONC, Alfacell Corporation, Somerset, NJ, USA) ist das kleinste und stabilste Mitglied der Ribonuclease A (RNase A) Superfamilie. Trotz einer Sequenzidentität von nur 28% sind die Tertiärstrukturen des Hauptvertreters dieser Strukturfamilie, der RNase A, und ONC weitgehend übereinstimmend. In der vorliegenden Arbeit wurde das Faltungsverhalten von ONC detailliert untersucht und mit bereits publizierten Erkenntnissen zur Faltung von RNase A verglichen. Mit Hilfe von manuellen bzw. stopped-flow Fluoreszenzmessungen, Einfach- und Doppelsprungexperimenten sowie Echtzeit-NMR-Experimenten wurden während der Faltung von ONC bis zu drei Rück- und zwei Entfaltungsreaktionen beobachtet. Alle kinetischen Daten konnten durch ein sequenzielles Faltungsmodell global angepasst und den einzelnen Faltungsreaktionen tatsächliche Faltungsereignisse zugeordnet werden. Demnach faltet ONC nach einer langsamen Peptidyl-prolylcis- zu-trans-Isomerisierungsreaktion im entfalteten Zustand schnell über ein Faltungsintermediat (IONC) sequenziell zum nativen Zustand. Mit Hilfe von quenched-flow-Experimenten in Kombination mit H/D-Austausch und 2D-NMR-Spektroskopie konnten Aussagen zum strukturellen Aufbau von IONC gemacht werden. Dabei wurde deutlich, dass IONC eine zu mindestens einem während der Faltung von RNase A auftretenden Intermediat vergleichbare Struktur aufweist. Dies zeigt, dass nicht nur die Tertiärstruktur der beiden homologen Proteine RNase A und ONC analog sind, sondern auch dass der Faltungsweg teilweise konserviert ist. Faltungsuntersuchungen an einer Variante von ONC, bei der die C-terminale Disulfidbrücke eliminiert wurde, was zu einer Verminderung der thermodynamische Stabilität um mehr als 30 kJ⋅mol-1 führt, verdeutlichten, dass diese Disulfidbrücke eine entscheidende Rolle für die Bildung von IONC während der Faltung von ONC spielt. Durch die röntgenkristallographische und NMR-spektroskopische Aufklärung der Raumstruktur dieser Variante sowie durch Dynamikstudien konnten mögliche Ursachen für die verminderte Aktivität und Stabilität sowie für das veränderte Faltungsverhalten der Variante im Vergleich zu ONC aufgeklärt werden.
Content:
The analysis of the folding behaviour of proteins with low sequence identity but comparable tertiary structures is a promising approach to unravel the relationship between sequence information, tertiary structure, and folding mechanism of proteins. Onconase® (ONC, Alfacell Corporation, Somerset, NJ, USA) is the smallest and most stable member of the ribonuclease A (RNase A) superfamily. Despite a sequence identity of only 28%, RNase A and ONC possess very similar tertiary structures. In the presented work the folding pathway of ONC is analyzed in detail and compared with published data on the folding behaviour of RNase A. By manual or stopped-flow fluorescence spectroscopy, single- or double mixing experiments as well as real-time NMR experiments, up to three refolding and two unfolding reactions were detectable during the folding of ONC. The folding reactions were assigned to defined folding events. All kinetic data could be globally fitted to a sequential three-state folding model and the folding reactions could be assigned to defined folding events. After a slow peptidyl-prolyl cis-to-trans isomerization reaction in the unfolded state, ONC folds via an on-pathway intermediate (IONC) sequentially to the native state. By quenched-flow H/D exchange experiments coupled with 2D NMR spectroscopy the structural assembly of IONC could be determined. The results show that IONC closely resembles at least one of the intermediates occurring during the refolding of RNase A. Thus, not only the tertiary structures of the homologous proteins ONC and RNase A are analogous but also the folding mechanism is partially comparable. Studies concerning the folding of a variant of ONC, in which the C-terminal disulfide bond was eliminated by site-directed mutagenesis, resulting in a decreased thermodynamic stability by 30 kJ mol-1, indicate that the C-terminal disulfide bond is essential for the formation of IONC during the folding of ONC. The determination of the tertiary structure of the variant by X-ray crystallography and NMR spectroscopy as well as dynamic studies disclosed reasons for both the decreased activity and stability and for the changed folding behaviour of the variant in comparison to ONC.
Note:
Tag der Verteidigung: 27.07.2009
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Halle, Univ., Naturwissenschaftliche Fakultät I, Diss., 2009
Additional Edition:
Erscheint auch als Online-Ausgabe Schulenburg, Cindy Faltung und Dynamik von Onconase 2009
Language:
German
Keywords:
Hochschulschrift
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